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盛夏干货分享:ELISA样本准备完全指南
点击次数:185 发布时间:2020-07-22

    进行 ELISA 前制备样品的提示
    请参阅随试剂盒提供的实验方案,了解有关样品制备和兼容性样品类型的产品特定详细信息。

    该指南适用于制备 ELISA 测定法中用到的常规样本,而好的样品制备程序可根据所需测定靶标及测定方法作相应调整。选用新测定方法时,建议查阅相关文献选择与您样本相似的实验步骤作为参考。

    样品制备方法

    一、细胞培养物上清液
    1.将细胞培养上清移至离心管,4℃,1,500 rpm 离心 10 分钟。
    2.立即进行上清液的分装并于 -80℃ 保存。避免反复冻融。

    二、细胞提取物
    1.将细胞培养板放置在冰上。
    2.吸出培养基并用预冷 PBS 轻轻漂洗细胞一次。
    3.弃去 PBS ,向 100 mm 培养板加入 0.5ml 提取缓冲液。
    4.收集细胞,然后移至经过预冷的离心管中。
    5.短暂涡旋后冰上孵育 15-30 分钟
    6.4℃ 13,000  rpm 离心 10 分钟,沉淀不溶性内容物。
    7.将上清(这里是指可溶性细胞提取物)分装至预冷的离心管中,并于 -80℃ 保存。尽可能减少反复冻融次数。

    三、条件培养基
    1.将细胞接种到含完全(含血清)生长培养基的培养容器中,使细胞增殖达到预期的融合度。
    2.弃去培养基,用预温 PBS 小心洗涤。重复洗涤步骤。
    3.弃去 PBS 洗涤液并小心加入无血清培养基。
    4.孵育 1-2 天。
    5.将培养基移至离心管,4℃ 1,500 rpm 离心 10 分钟。
    6.立即分装上清并于 -80℃ 保存。避免反复冻融。

    四、乳汁
    1.收集样品,10,000 x g 4℃离心 2 分钟。
    2.分装上清液并于 -80℃ 保存。避免反复冻融。

    五、血浆
    1.将全血收集到含抗凝剂的管中,例如 BD 抗凝真空采血管(目录号:363080/363080)或添加 0.1M 柠檬酸钠至 1/10 终体积。
    2.4℃ 3,000 rpm 离心 10 分钟。
    3.立即分装上清(血浆)并于 -80℃ 保存。避免反复冻融。

    六、尿液
    1.收集样品,10,000 xg 4℃离心 2 分钟。
    2.分装上清并于 -80℃ 保存。避免反复冻融。

    七、唾液
    1.收集样品,4℃ 10,000 xg 离心 2 分钟。
    2.立即分装上清并于 -80℃ 保存。避免反复冻融。

    八、血清
    1.将全血收集到未经处理的测试管中,或者到不含抗凝剂的管中,如 BD 血清用真空采血管。
    2.室温孵育 20 分钟。
    3.4℃ 3,000 rpm 离心 10 分钟。
    4.立即分装上清(血清)并于 -80℃ 条件下保存。避免反复冻融。

    九、组织提取物
    1.用干净的工具解剖组织,best在冰上、尽快进行,以防止被蛋白酶降解。
    2.将组织置于圆底的微量离心管中,并浸入液氮中 “速冻”。将样品保存在 -80℃ 以便后续使用或放置在冰上进行直接匀浆。
    3.对于约 5 mg 的组织块,可向管中添加约 300 µl 完全提取缓冲液(查看细胞/组织提取缓冲液配方),然后用电动匀浆器匀浆。
    4.清洗刀片两次,每次清洗使用 300µl 完全提取缓冲液,然后在 4℃ 下维持恒定搅拌 2 小时(例如置于冷室中的回旋振荡器上)。
    5.4℃ 13,000 x rpm 离心 20 分钟。置于冰上,将上清液(这里是指可溶的蛋白质提取物)分装至新、预冷的管中并在 -80℃ 保存。避免反复冻融。

    裂解缓冲液的体积必须根据所用组织的量进行确定。最终蛋白质提取物的浓度一般 > 1 mg/mL。

    细胞/组织提取缓冲液配方:
    100 mM Tris,pH 7.4
    150 mM NaCl
    1 mM EGTA
    1 mM EDTA
    1% Triton X-100
    0.5% 脱氧胆酸钠

    制备完全提取缓冲液所需的其它试剂:
    磷酸酶抑制剂混合物
    蛋白酶抑制剂混合物
    PMSF

    使用前,按照厂家描述加入磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物以及终浓度为1mM的PMSF。

    通用建议
    1.推荐的蛋白质提取物浓度为至少 1-2 mg/mL。
    2.通常,可用缓冲液将血清、血浆、细胞和组织提取物稀释2倍。
    3.样品融化后,使用前,将样品在 4℃ 10,000 x rpm 离心 5 分钟以除去沉淀。

 

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